蛋白純化四大層析原理

基本原理：凝膠層析亦稱(chēng)凝膠過(guò)濾、排阻色譜或分子篩層析等。其機(jī)理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類(lèi)物質(zhì)。單個(gè)凝膠珠本身象“篩子"。不同類(lèi)型凝膠的篩孔的大小不同。分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來(lái)，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；小分子物質(zhì)要通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。一般來(lái)說(shuō)，凝膠過(guò)濾層析柱越細(xì)、越長(zhǎng)純化的效果越好。

基本原理：據(jù)負(fù)載電荷的不同分離蛋白質(zhì)，分辨率高且對(duì)樣品的容納能力強(qiáng)。分離原理是基于帶電蛋白質(zhì)和帶相反電荷的色譜介質(zhì)之間的可逆相互作用。蛋白質(zhì)結(jié)合到柱子上，然后改變條件，使結(jié)合物逐步被洗脫。

這種洗脫通常是通過(guò)增加鹽濃度或pH值的變化來(lái)進(jìn)行，采用逐步調(diào)整或連續(xù)梯度進(jìn)行洗脫。最常見(jiàn)的，使用鹽（氯化鈉）溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過(guò)結(jié)合過(guò)程濃縮靶蛋白，并且以純化、濃縮的形式收集。

基本原理：根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異分離蛋白質(zhì)。分離的依據(jù)是蛋白質(zhì)與層析介質(zhì)的疏水表面之間可逆的相互作用。這種作用在高離子強(qiáng)度緩沖液中增強(qiáng)，從而疏水性相互作用層析成為硫酸銨沉淀或離子交換層析過(guò)程高鹽溶液洗脫后理想的“下一步"。樣品在高離子強(qiáng)度溶液（如1.5M硫酸銨）中結(jié)合到柱子上。然后改變條件，使結(jié)合的物質(zhì)逐漸洗脫下來(lái)。

洗脫通常是通過(guò)降低鹽濃度。鹽濃度要逐步調(diào)整或有一個(gè)持續(xù)減少的梯度。最常見(jiàn)的是通過(guò)硫酸銨鹽濃度遞減的梯度來(lái)洗脫樣品。在結(jié)合過(guò)程中靶蛋白被集中，并以純化和濃縮的形式被收集。其他洗脫程序包括降低洗脫液極性，使用促溶劑（尿素、鹽酸胍）或使用去污劑，改變pH值或溫度。

基本原理：據(jù)特異性生物識(shí)別，即一種蛋白（或一組蛋白質(zhì)）和色譜基質(zhì)上一種特定的配體間可逆的相互作用。這項(xiàng)技術(shù)是捕獲或中度純化步驟理想的選擇，只要靶蛋白有合適的配體就可以使用該技術(shù)。